粒曼专注于为生物医疗领域提供细胞体外基因敲除解决方案，致力于为客户定制基因敲除服务。目前，我们已经推出了多种细分的敲除服务，欢迎咨询尊龙凯时团队，以获取技术路线和成功案例的详细资料。

我们的服务涵盖真核细胞的体外基因敲除定制，针对该服务，尊龙凯时团队将定期更新常见问题解答（Q&A），以便更好地满足客户的需求。以下是最新版本的Q&A内容：

常见问题解答

1-20：关于基因敲除定制服务的相关问题请参考我们的服务指南和尊龙凯时高通量基因敲除定制服务（RNP法）。

21. 如何验证基因敲除是否成功？

22. 精准敲除与模糊敲除的区别是什么？

(1) 精准敲除：通过同源重组（HDR，Homology-Directed Repair）机制，在目标基因中引入精确的修饰，如特定片段的删除、点突变或插入，从而完全或部分失活基因功能。与传统的模糊敲除不同，精准敲除服务会针对靶基因的特定区域进行精准的核苷酸序列操作。

(2) 模糊敲除：通过非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）机制，在目标基因的指定区域内随机引入插入或缺失突变，导致基因编码框的移位或提前终止，从而破坏该基因的功能。

23. CRISPR/Cas9方法能够敲除的最大片段范围是多少？

理论上，可以敲除1kb至1Mb范围的片段。结合多靶点切割技术或其他方法（例如CRISPRa/i、表观遗传修饰），可实现超大片段敲除（可达1Mb）。

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？

可以通过病毒载体（如慢病毒/AAV）整合至基因组、使用电场诱导细胞膜穿孔或将Cas9-RNP直接导入难以转染的细胞（如原代T细胞），以及利用脂质纳米颗粒阳离子脂质包裹Cas9-sgRNA复合物来优化编辑效率。

25. 如何提高基因敲除效率？

26. 如何分析基因敲除后的表型变化？

27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？

28. CRISPR RNP法适用的细胞和场景有哪些？

结论

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法通过将靶基因对应的多条体外合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（RNP），利用电转化或脂质体转染的手段，以“瞬时”转染的方式将RNP递送到细胞内。这种方法不仅可以获得高效、稳定遗传的细胞池，且避免了传统慢病毒或质粒法中可能出现的体内转录翻译及抗性筛选过程。由于RNP在细胞内72小时内完成基因组编辑后即被降解，且不引入外源序列，因此能够尽可能保持细胞表型。相较于传统方法，CRISPR/Cas9 RNP法在降低脱靶效应和避免病毒基因组随机整合方面表现优异，因此可以有效促进后续功能性实验的开展。

总之，利用尊龙凯时的CRISPR/Cas9 RNP法进行基因敲除细胞系的构建正逐渐成为一种新的主流选择，未来将全面替代传统方式，推动生物医疗事业的发展。