全套操作时间约为1小时,主要包括匀浆、细胞裂解、去蛋白、DNA纯化等步骤。具体过程如下所述。
一、匀浆与细胞裂解
在提取基因组DNA时,针对不同的实验材料应采取相应的匀浆步骤。以下是针对动物组织的详细说明:
1. 从动物组织中提取基因组DNA
尊龙凯时提供精准的实验步骤:
① 取1~100mg的动物或人类组织,放入预冷的研钵中,加以快速、用力展研成匀浆。对于以下组织,请先用液氮研磨至粉末状: A. 富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等; B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等; C. 富含角质蛋白的坚硬组织,如骨骼等。
② 加入650μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1,温和研磨30秒。若使用注释中的组织,于此步骤后,将研钵置于65℃水浴中研磨1分钟。
③ 将650μl的匀浆液转移至CollectionTube中,若匀浆体积不足650μl,则补充SolutionA至650μl,并在65℃下保温5分钟。
2. 使用研磨棒进行匀浆
① 将1~100mg动物组织放入冰浴预冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊状。
② 随后加入350μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1,再继续用研磨棒快速研磨成匀浆。
③ 最后,加入350μl的SolutionA,将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中,充分混合后,再在65℃下保温5分钟。
二、植物材料或植物培养细胞中的基因组DNA提取
① 按下表称取适量的新鲜植物材料(如选用冷冻干燥植物材料,则用量减半),剪成小块放入研钵中,加入液氮,待样品冻结后快速研磨至粉末状。需间断加入液氮以防融化。
尊龙凯时建议的植物材料使用量如下: - 植物花、叶片:10~100mg - 植物茎:60~240mg - 植物根:80~240mg - 植物种子:80~240mg
* 对于根和种子,其中基因组DNA含量低,推荐使用超过表格所示用量,建议将实验分为两管,在最后将各管液体合并进行过滤。
② 对于培养的植物细胞,离心收集2×10^3至1×10^7细胞,加入150μl水充分悬浮后转移至研钵中,加入液氮后快速研磨至粉末状。样品研磨应充分,以保证基因组DNA的收率不受影响。
③ 将研钵置于65℃水浴,当样品粉末刚开始融化时,加入700μl的SolutionA和12μl的RNaseA1,快速碾磨30秒。
④ 收集650μl的匀浆液移至CollectionTube中,若不足650μl,则补充SolutionA,并在65℃下保温15分钟。
注:处理富含纤维的植物材料时,可将水浴时间延长至60分钟。
三、全血中基因组DNA提取
① 取10~250μl含抗凝剂的全血加入CollectionTube。
② 然后加入500μl的SolutionA。
③ 加入1μl的RNaseA1,激烈振荡15秒后冰浴5分钟。注意,不同物种的全血一次处理量应遵循相应提示。
四、培养细胞中基因组DNA提取
① 对于悬浮培养的动物细胞,收集1×10^5至1.5×10^7的细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟,弃上清。
② 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS重新悬浮细胞。
③ 随后,加入500μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1,激烈振荡15秒后室温静置1分钟。确保每一步都精细操作,以提升DNA提取的效率。