当科研团队分享他们珍贵的RNA样品时，我们常常听到：“快把那根试管放冰上！”以及“希望它不会降解。”RNA本身在分子生物学研究中相较于DNA或蛋白质等其它大分子，其稳定性较低。因此，在CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）同样面临着“易碎”的问题。

为了解决这一问题，研究显示gRNA可以通过化学修饰来增强其抵抗降解的能力，同时依然能够有效引导Cas9产生靶向断裂。这些技术的进步不仅提升了靶向效能，也减轻了研究人员在RNA状态上的忧虑。此外，一些gRNA的修饰还可增强其稳定性、添加“颜色”或改变“开关”的功能。

通过稳定的gRNA修饰，磷酸糖骨架对CRISPR/Cas9靶向的识别序列由约20个核苷酸的gRNA引导，且该gRNA为较大crRNA的一部分。除了20个核苷酸的向导序列外，crRNA的3'末端还包括一个约20个核苷酸的重复区域。该重复区域与Cas9蛋白互作，并与反式激活crRNA（tracrRNA）相关。这些RNA分子容易受到细胞质和核酸酶的攻击，因为它们可能被识别为外源RNA。为了保护这些RNA，科学家们已开发出几种简单的方法，通过对RNA的糖或磷酸分子进行修饰来提高其稳定性。

自然界早已进化出防止重要细胞RNA分子降解的机制。其中一种常见的保护方法是2'-O-甲基化，这种修饰通过在核糖的2'羟基上添加甲基，来保护RNA不受到溶核攻击。此外，在同一位置的另一种稳定修饰是2'-氟（2'-F），它用氟取代了2'位置的羟基。将糖环移动一个位置，可以得到流行的3'-硫代磷酸酯键，其中硫取代了非桥接的磷酸氧。其他有用的骨架修饰包括酰胺键、锁定核酸和受限制的乙基。

哪种RNA骨架修饰表现最佳呢？研究表明，将几种修饰组合在一起，如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰，相较于单独使用任何一种修饰，表现出更高的稳定性。这些修饰可以在实验室使用市售试剂盒完成，或在购买gRNA时以合成修饰的形式订购。通常，这些修饰被掺入crRNA分子的末端，以确保最优的稳定性和效能。对于碱基修饰，其实还有比RNA更稳定的替代品，答案就是脱氧核糖核酸（DNA）!

一种在预算内提高gRNA效率的方式是将若干核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸。含有部分DNA的gRNA对Cas9蛋白表现出惊人的耐受性，同时能显著提高靶向效率。同样，锁定核酸或桥接核酸也可引入到gRNA中。这些修饰使得RNA构象受到限制，从而提升错配鉴别能力，增加对核酸酶的抗性，减少脱靶事件。虽然这两类修饰具有相似优点，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率略高且毒性更低。

在CRISPR/Cas9技术进步的背景下，部分RNA稳定修饰是在用于siRNA及反义寡核苷酸的研究中开发的。这些合成修饰，尤其是那些不含5'-三磷酸盐的gRNA修饰，会降低与gRNA引入关联的先天免疫反应。这在因引入外源RNA而损害活力或正在研究自身免疫力的实验中尤为关键。

此外，目前gRNA修饰的新进展允许使用可光激活和可光切割的gRNA来克服这些问题，通过在gRNA的20nt靶向区域引入单个可光切割的接头来实现。这些gRNA在适宜光源照射下，不到一分钟便会被裂解，从而失去功能。该系统的光激活对应物则使用被光笼住的gRNA，在短暂的光照条件下开始靶向编辑事件。这些技术都充分利用了对RNA的化学修饰，通过简单的LED灯即可控制整个编辑系统。

在靶向实验中，对gRNA进行染料标记可以直观展示转染效率，甚至在细胞实验中用于追踪定位。市场上有多种合适的染料可供选择，您可以选择自助使用试剂盒，或购买带标签的商业合成染料。如果您需要特定的染料，您还可以选择对crRNA或tracrRNA进行染料标记。在单个向导系统（即crRNA与tracrRNA作为一个分子）中，可能并不需要此方案，但您依然可以自由选择使用的染料。

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